Разработка и валидация метода жидкостной хроматографии в сочетании с диодно-матричным детектором (LC-DAD) для измерения митотана (DDD) в образцах плазмы – Elsevier

Полный текст статьи

Митотан (о, п’-ДДД) является препаратом выбора при адренокортикальной карциноме (АКК), и его измерение в плазме имеет важное значение для контроля введения лекарственных средств. Целью данного исследования было разработать и валидировать простой, надежный и понятный метод определения митотана в образцах плазмы. Образцы плазмы, не содержащие лекарственных препаратов, собирали в пробирки с этилендиаминтетраацетатом калия (К-ЭДТА) и добавляли митотан (ДДД) в концентрациях 1,0,2,5,10,0,25,0 и 50,0 мкг/мл. П, п’-ДДД использовали в качестве внутреннего стандарта (ИС) и добавляли в концентрации 25,0 мкг/мл ко всем образцам, стандартам и контролям. Образцы подвергали осаждению белков ацетонитрилом, а затем центрифугировали. 50 мкл супернатанта вводили в систему ВЭЖХ, соединенную с диодно-матричным детектором (ДАД). DDD и внутренний стандарт (IS) детектировали при 230 нм в изократическом режиме в течение 12 мин с использованием смеси растворителей, состоящей из 60 % ацетонитрила и 40 % муравьиной кислоты в воде с добавлением 0,1 % раствора, перемешиваемого насосом, при скорости потока 0,6 мл/мин, в хроматографической колонке с обращенной фазой (C18), поддерживаемой при температуре 28 °C. Были оценены чувствительность, селективность, точность, наличие переноса, степень извлечения и матричный эффект, линейность и правильность метода. Метод, предложенный в данном исследовании, обеспечил симметричную форму пика и хорошее разрешение базовой линии для DDD (митотана) и 4,4’-DDD (внутреннего стандарта) со временем удерживания 6,0 мин и 6,4 мин соответственно, с разрешением выше 1,0. Эндогенные соединения плазмы не мешали анализируемым пикам при сравнении плазмы без аналита и плазмы с добавлением стандартов. Линейность оценивали в диапазоне 1,00–50,00. мкг/мл для митотана (R2 > 0,9987 и эффективность экстракции 97,80 %‒105,50 %). Аналитическая чувствительность составила 0,98 мкг/мл. Функциональная чувствительность (LOQ) составила 1,00 мкг/л, внутрилабораторный и межлибораторный коэффициенты вариации были менее 9,98 %, и перенос вещества не наблюдался. Степень извлечения варьировалась от 98,00 % до 117,00 %, линейность — от 95,00 % до 119,00 %, а точность — от 89,40 % до 105,90 % без матричных эффектов или помех при измерениях митотана. Результаты анализа образцов пациентов сравнивались с предыдущими измерениями методом ГХ-МС с высокой корреляцией (r = 0,88 и смещение = -10,20 %). Определение DDD в образцах плазмы с помощью разработанного и валидированного метода является простым, надежным, эффективным и чувствительным методом для терапевтического мониторинга лекарственных средств и управления дозой с целью достижения терапевтического индекса митотана у пациентов с раком надпочечников. Адренокортикальная карцинома (АКК) — редкое злокачественное новообразование эндокринной системы, возникающее из одного из трех корковых слоев надпочечника. АКК может вызывать увеличение выработки одного или нескольких стероидных гормонов, таких как кортизол, андрогены и альдостерон, что приводит к клиническим проявлениям синдрома Кушинга, вирилизации и гипертонии. 1 Митотан (о, п'-ДДД) или (1,1-дихлор-2- -2- этан, ДДД) — единственный одобренный препарат для лечения адренокортикальной карциномы (АКК). Внутринадпочечниковая метаболическая трансформация необходима для терапевтического эффекта ДДД, который метаболизируется в ДДЕ (о, п'-ДДЕ) и ДДА (о, п'-ДДА) путем α- и β-гидроксилирования соответственно (рис. 1 и 2). Митотан метаболизируется через реактивный ацилхлорид связывать бионуклеофилы коры надпочечников, а также выступать в качестве промежуточного звена в образовании о, п'-ДДА. вероятно, посредством фермента цитохрома P450 (CYP). 2-4 Точный механизм действия DDD до сих пор находится в стадии исследования, как и полная роль метаболитов, связанных с DDD: DDA и DDE. 5-7 Митотан имеет узкий терапевтический индекс, мониторинг уровня митотана в плазме во время лечения позволяет быстрее достичь терапевтического уровня в плазме (14–20 мкг/мл), а также минимизировать побочные эффекты, связанные с чрезмерно высоким уровнем в плазме. 6 Уровни митотана более 20 мг/л связаны, в том числе и у детей, с нейротоксичностью. 8,9 В настоящее время митотан является единственным адренолитическим препаратом, применяемым в качестве монотерапии или адъювантной терапии при тяжелой и запущенной адренокортикальной карциноме. 10 Из-за высокой липофильности DDD подготовка образцов и жидкостная хроматография становятся довольно сложной задачей. 11 В группе гидрофобных препаратов, Митотан также страдает от присущей ему низкой растворимости в воде и низкой биодоступности. 12 Методы ВЭЖХ представляют собой достойную альтернативу газовой хроматографии13 для мониторинга уровней ДДД в плазме, обеспечивая менее трудоемкую подготовку образцов и более быстрое получение результатов анализа. Целью данной работы было разработать и валидировать простой, надежный и понятный метод определения митотана в образцах плазмы. Из-за высокой гидрофобности и неполярной химической природы митотана (ДДД) наилучшим выбором стал режим обращенно-фазовой хроматографии. Были также оценены различные химические составы колонок с октадецилсиликагелем (C18), и колонка Waters HSS T3 C18 с размером частиц 1,7 мкм показала наилучшее разрешение между ДДД и внутренним стандартом 4,4'-ДДД в изократическом режиме по сравнению с градиентным режимом элюирования. Было учтено высокое химическое сходство между структурами молекул DDD и 4,4’-DDD для выбора наилучшего внутреннего стандарта, и при оптимальных условиях разработки было достигнуто соответствующее разрешение. Что касается выбора подвижной фазы, в качестве органического модификатора был выбран ацетонитрил, а pH подвижной фазы поддерживался на уровне 2,3 с 0,1% муравьиной кислотой в воде, что привело к очень хорошей форме пиков при скорости потока 0,6 мл/мин. Симметричная форма пика и хорошее разрешение базовой линии для DDD и 4,4’-DDD были получены со временем удерживания 6,0 мин и 6,4 мин соответственно, с разрешением пика выше 1,0 (рис. 3). Окончательная комбинация подвижной фазы состояла из 40% 0,1% муравьиной кислоты в воде и 60% ацетонитрила (об/об), перемешиваемых насосом. Авторы обнаружили, что как DDD, так и 4,4’-DDD обеспечивают лучшее поглощение УФ-излучения на длине волны 230 нм по сравнению с длиной волны 226 нм. Была исследована температура колонки, которая была установлена ​​на номинальном значении 28 °C, что является важным параметром для колонок UPLC с мелкими частицами, позволяющим избежать размытия хроматографической полосы, вызванного подвижной фазой/атритом частиц. Что касается пробоподготовки, ацетонитрил оказался наилучшим растворителем для осаждения белков и достижения высокой степени извлечения DDD, с добавлением в конце подкисленной водной фазы 0,1% раствора муравьиной кислоты. Значения степени извлечения подтвердили хорошую точность метода без матричного эффекта (> 0,99 корреляции), а также селективность метода. Стандартная кривая была линейной в исследованном диапазоне концентраций (от 1,0 до 50,0 мкг/мл) с R2 > 0,9987 и эффективностью экстракции от 97,8% до 105,5%. Аналитическая чувствительность (предел количественного определения, LOD) составила 0,976 мкг/мл, а функциональная чувствительность (нижний предел количественного определения, LOQ) была определена как приблизительно 1,00 мкг/мл. Метаболиты DDD не мешали этому методу. Точность составила 3,89 %, 2,28 % и 2,43 % для внутрилабораторных оценок и 9,98 %, 5,39 % и 5,01 % для межлибораторных. Погрешность варьировалась от 89,4 до 105,9 % (таблица 1). Образцы пациентов ранее были оценены в вспомогательной лаборатории, сотрудничающей с нами, с коэффициентом корреляции результатов 0,88 и смещением -10,2 по сравнению с методом ГХ-МС (рис. 4). Митотан также был оценен на предмет стабильности в рамках валидационных исследований. Для тестирования было отобрано пять образцов пациентов. Наборы хранились при комнатной температуре (дни 0–7), в холодильнике (дни 0–15) и в режиме заморозки-оттаивания (дни 0–30). Результаты при комнатной температуре показали наибольшую вариацию в течение дней. С 0 по 2 день вариации составляли всего 0,90 %. % и достигали 27,12 % за последние 7 дней воздействия. Что касается воздействия холодильника, то с 0 по 2 день наблюдались колебания от 1,68 % до 19,05 % к 15 дню. При воздействии циклов замораживания-оттаивания колебания в течение 0–30 дней достигали 16,97 %, а после 30 дней – 16,97 %. Все колебания находились в пределах 20 % допустимых значений, за исключением комнатной температуры, при которой после 7 дней наблюдалось ухудшение качества образца. Разработанный и валидированный метод LC-DAD является простым, надежным, эффективным и чувствительным методом измерения уровня митотана в образцах плазмы пациентов и может стать альтернативой методам GC-MS с менее трудоемкой подготовкой образцов и более коротким временем анализа. Метод был оценен с использованием образцов более чем 35 пациентов с раком надпочечников, получающих терапию митотаном. Метод оказался стабильным и идеально подходит для терапевтического мониторинга лекарственных средств, позволяя корректировать дозу для достижения терапевтического индекса митотана. Данное исследование было одобрено Медицинским этическим комитетом Совета клинического руководства больницы Hospital das Clinicas. Медицинский факультет Университета Сан-Паулу (2023). Все процедуры, выполненные в данном исследовании, соответствовали этическим стандартам институционального комитета по медицинской этике. Исследование требовало этического одобрения Plataforma Brasil, CEP CAAE № 62465721.0.0000.0068, регистрационный номер документа: 6.053.869. Для исследования не требовалось информированное согласие. DDD и 4,4’-DDD были приобретены у Chem Service Inc. (США). Метанол, муравьиная кислота и ацетонитрил, растворители для ВЭЖХ, были приобретены у Supelco (Merck KGaA, Дармаштадт, Германия). Вода была получена с помощью монитора TOC MilliQ Integral 15, A10 (Millipore, Merck KGaA, Дармаштадт, Германия). Все исходные стандартные растворы соединений были приготовлены в метаноле с концентрацией 1 мг/мл и хранились при -20 °C. Плазма, не содержащая лекарственных препаратов. Образцы, собранные в пробирки с этилендиаминтетраацетатом калия (К-ЭДТА), были обогащены добавками в концентрациях 1,0,2,5,10,0 и т. д. Уровни ДДД составляли 25,0 и 50,0 мкг/мл. Для обеспечения двух уровней контроля был выбран пул образцов пациентов с низкой и высокой концентрациями. Двести мкл образцов плазмы, стандартов и контролей переносили в микроцентрифужные пробирки. Белки осаждали добавлением 2-кратного объема (400 мкл) ацетонитрила, содержащего 25 мкг/мл 4,4'-ДДД в качестве внутреннего стандарта (ИС), и перемешивали на вортексе в течение 20 с. Смесь центрифугировали второй раз при 14500 × g в течение 15 мин в микроцентрифуге Herolab MicroCen16 (GmbH Laborgeräte, Германия). К супернатанту добавляли 100 мкл 0,1% муравьиной кислоты в воде, перемешивали на вортексе и центрифугировали при 14500 × g в течение 15 мин. Мин снова. Надосадочную жидкость перенесли в стеклянные флаконы для автосамплера, и 50 мкл ввели в хроматографическую систему. Хроматографическое исследование проводилось на системе Agilent Infinity 1260 II, оснащенной кватернарным поршневым насосом 1260 Flexible Pump, термостатом для колонки 1260 MCT, автоинжектором 1260 Multisampler и УФ-детектором DAD HS с переменной длиной волны (Agilent Technologies, Санта-Клара, Калифорния, США). Сбор и интеграция данных осуществлялись с помощью компьютерной системы интеграции OpenLab для определения площадей пиков. Разделение проводилось в изократическом режиме с использованием смеси растворителей A: 60 % ацетонитрила и B: 40 % муравьиной кислоты в 0,1 % воде, перемешиваемой насосом, при скорости потока 0,6 мл/мин через колонку Waters Acquity HSS T3 (100 × 2,1 мм, 5 мкм) (Waters Technologies, Милфорд, Массачусетс, США) при температуре 28 °C, а также предколонки Phenomenex SecurityGuard ULTRA C18. (Phenomenex, Торранс, Калифорния, США). Общее время анализа составило 12 минут, детектирование с помощью диодного детектора проводилось при длине волны 230 нм. Валидация биоаналитических методов проводилась в соответствии с рекомендациями Института стандартов клинических лабораторий (CLSI)14 и RDC 27/2012, RDC 166/2017 – ANVISA15,16 и включала: аналитическую и функциональную чувствительность, селективность, линейность, точность, правильность, степень извлечения, матричный эффект, оценку помех и перенос, которые описаны ниже. Аналитическая чувствительность определялась как наименьшая концентрация, отличающаяся от концентрации в контрольном образце. Функциональная чувствительность определялась как наименьшая концентрация с межаналитической вариацией менее 20 %. Линейность оценивалась путем смешивания в различных пропорциях образца с высокой концентрацией митотана с образцом с низкой концентрацией митотана. Исследования точности проводились с использованием двух образцов с разной концентрацией; для внутрианалитической проверки в один и тот же день анализировали 10 аликвот каждого образца. Для сравнения результатов между анализами было проведено 20 повторов в течение пяти дней. Точность оценивалась путем измерения степени извлечения путем добавления стандартов к трем образцам без DDD и сравнивалась с эталонным методом (ГХ-МС) и ожидаемыми результатами. Степень извлечения и матричный эффект оценивались путем сравнения наклонов, полученных в растворителе и в реальной матрице (добавления стандартов). Образцы, содержащие DDA и DDE, метаболиты DDD, были протестированы в этом методе для оценки потенциального влияния. Перенос оценивался, когда потенциальное предшествующее повышение концентрации аналита могло повлиять на результаты. Он исследовался путем анализа двух образцов аналита с низкой и высокой концентрациями и сравнения стандартного отклонения (SD) 11 повторов с низкой концентрацией и 10 повторов с высокой концентрацией в следующем порядке: 3 низких, 2 высоких, 1 низкая, 2 высоких, 4 низких, 2 высоких, 1 низкая, 2 высоких, 1 низкая. 2 образца с высокой и 1 образец с низкой концентрацией. Стабильность DDD оценивали в плазме, подвергнутой воздействию различных условий: 0,2,3,5 и 7 дней при комнатной температуре, 10 °C и -20 °C. Результаты анализировали с помощью программного обеспечения EP evaluator (David G. Rhoads Associates, Inc, Kennett Square, PA) или EXCEL® (Microsoft Corporation, США). Метаболизм митотана с помощью фермента цитохрома P450. Митотан и его метаболиты DDA и DDE. Полученная хроматограмма, показывающая симметричную форму пика и хорошее разрешение базовой линии для DDD (митотана) и 4,4'-DDD (внутреннего стандарта) со временем удерживания 6,0 мин и 6,4 мин соответственно. Характеристики метода LC-DAD и критерии приемлемости. Корреляция между результатами, полученными с помощью LC-DAD и GC-MS (золотой стандарт). (r = 0,88 и смещение = -10.2)